Nová metoda pomohla lépe pochopit fungování mikrotubulů, které stojí za základními biologickými procesy. Soubor nových mikroskopických metod představili vědci z Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR a Biotechnologického ústavu AV ČR ve vědeckém časopise Small Methods.
Vědci si kladli za cíl zobrazit a prozkoumat mechanismy dynamických buněčných struktur pomocí vysokorychlostního snímání. Optická mikroskopie nabízí dosud nepřekonané možnosti sledovat změny a funkce základních biologických soustav ve viditelném světle. Vykreslení zobrazených detailů však naráží na omezení optického rozmazání obrazu nazývaného difrakční limit. „Průlomové metody založené na super-rozlišovací mikroskopii laureátů Nobelovy ceny dnes již běžně rozkrývají nanoskopické detaily o poloze určitých biomolekul,“ přibližuje Marek Piliarik z Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR. „Nahlédnout, jak tyto biomolekuly pracují a jak se mění, ale optická mikroskopie nikdy nedokázala. To jsme změnili a poprvé jsme pozorovali změny tvarů a vzájemných interakcí minimálních shluků bílkovin,” vysvětluje přínos studie.
Nová mikroskopická metoda umožňuje přímé pozorování změny tvaru nanoskopických struktur složených jen z několika molekul, a dokáže tak odhalit molekulární mechanismy skryté hluboko pod rozlišovací schopností optického mikroskopu.
Miliony snímků za sekundu: ultracitlivě, bez značkování
K dosažení této úrovně detailu byla použita ultracitlivá zobrazovací metoda, označovaná jako mikroskopie interferometricky detekovaného rozptylu. Právě tuto metodu před lety poprvé použil jeden ze spoluautorů publikované práce k přímému pozorování jednotlivých proteinů bez použití (fluorescenčních) značek přidaných dodatečně k měřenému vzorku. Tým vědců z uvedených pracovišť Akademie věd nyní posunul možnosti této metody a dokázal přesně změřit nejenom polohu krátkých řetízků bílkovin, ale i jejich okamžitý tvar. „Věřím, že naše metoda otevře celou škálu nových aplikací podobných super-rozlišovací mikroskopii, které ale nebudou vyžadovat světlo z fluorescenčních značek. Namísto toho rozpozná různé tvary a formace nepozměněných proteinových struktur,” představuje svou vizi Marek Piliarik.
Nové metody vědci využili k popsání změn souvisejících s rozpadem buněčné kostry mikrotubulů. „Skutečnost, že jsme dokázali sledovat proměny tvaru malých shluků bílkovin těsně předtím, než se rozpadnou, nás ohromila,“ přibližuje Milan Vala z Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR, jeden z autorů publikované práce. „Když si navíc uvědomíme, že tato metoda je schopná neinvazivního zobrazování řádově až s milionem snímků za sekundu, vidíme její velký potenciál stát se oknem k pochopení nitrobuněčných mechanismů a velkou příležitostí pro celou optickou mikroskopii,” upozorňuje Milan Vala.
Jedinečné mikrotubuly
Mikrotubuly jsou mimořádně proměnlivé buněčné struktury, které samovolně, opakovaně a velmi rychle rostou a zkracují se, a tím plní svou funkci v životadárných procesech, jako je dělení nebo pohyb buněk. Na konečcích rozpadajících se mikrotubulů byly ve statických obrázcích z elektronového mikroskopu již před desítkami let objeveny zakřivené, pouhé nanometry velké struktury. Protože však nebylo možné přímo sledovat vznik těchto bílkovinových formací v reálném čase, hlubší souvislosti mechanismů řídících rozpad mikrotubulů se změnami a dynamikou jednotlivých bílkovin setrvávaly dosud v rovině hypotéz a modelů.
Nová práce nyní ukazuje, jak je možné měřit drobné odchylky ve vlastnostech světla rozptýleného na strukturách složených z pouhých několika molekul a z nich dokonce rozlišit jejich okamžitý tvar (konformaci). Vědci tak byli schopni zachytit poměrně detailní choreografii, četnost a velikost výchylek těchto proměnlivých struktur v prostoru i čase. Zdeněk Lánský z Biotechnologického ústavu AV ČR zdůrazňuje biologický aspekt této práce: „Unikátní rozlišení této metody nám umožňuje lépe pochopit dynamické změny ve struktuře mikrotubulů – až donedávna nezachytitelných mechanismů, které stojí v pozadí základních biologických procesů, jako je buněčné dělení.”
